Ензими

Принципи и задачи на определянето на ензимната активност

Ензимите са белтъци. Те ускоряват скоростта на химични реакции. Биохимичните процеси протичат почти винаги с участието на ензими като катализатори. Съответно на това има голям брой различни ензими в клетките на организма. Всяка клетка съдържа еднакво количество генетична информация. Според функцията и степента на специализация на органа тази информация се осъществява частично, при това за различните органи в съвсем различна степен. Вътреклетъчната концентрация на ензимите се различава значително в отделните органи.

Това важи както за общата активност на даден ензим, така и за мултиплените му форми (изоензимите). Всеки тип клетки съдържа необходимите за своята обмяна различни ензими и изоензими. Този набор не е постоянен. Наборът от ензими се променя значително при промяна в обменните процеси и при болестни състояния.

Локализация на ензими

Ензимите, откривани в телесните течности и използувани за диагностични цели, се освобождават по различни начини от клетките:

• секреция
• увреждане на клетките
• нарушаване на пермеабилитета на клетъчните мембрани
• увеличаване на вътреклетъчната концентрация на ензими чрез индукция на белтъчна синтеза
• загиване на клетки
• освобождаване на мембранносвързани ензими

Често при клетъчно увреждане, обусловено от болестен процес, участват два или повече от тези механизми на освобождаване на ензими от клетките. Ензимите са чувствителни индикатори на причинени от болестните процеси изменения, като промените в тяхната активност често се долавят, преди да се прояви клиничната симптоматика. Стремежът за локализиране на органни изменения, възникнали в резултат на болестния процес, чрез съпоставяне на промените в ензимната активност в изследваната биологична течност (например серум) в хода на диференциално-диагностичния процес е оправдан. За съжаление това в много случаи не може да се осъществи. Предпоставка за възникващите затруднения са следните причини:

• Вътреклетъчният набор от ензими се променя при заболявания
• Клетъчните ензими са прикрепени към различни структури. В зависимост от естеството и тежестта на увреждането в различна степен се отделят ензими, разтворени в цитозола, включени в клетъчните органели и свързани към мембраните. Само при остър некротичен процес ензимната находка в серума съответства в значителна степен на набора от ензими в засегнатия орган.
• Различните ензимни белтъци се разграждат с различна скорост в кръвната плазма

Полуживот на ензими в кръвната плазма

• Според големината и формата на молекулата им различните ензими се разпределят с различна скорост между вътресъдовата и междуклетъчната течност.
• Промени в количеството на заобикалящата вода повлияват ензимите, както и всички други белтъци.

Няма абсолютно органноспецифичен ензим или набор от ензими. Определени констелации от ензимни активности позволяват само да се правят ограничени изводи относно вида и разпространението на болестния процес. Нараства значението на използването на т.нар. мултиплени форми на ензимите в ензимната диагностика. С това название се означават всички белтъчни молекули с еднаква ензимна активност, без да се взема предвид причината за различията в структурата. В случай че причината за тези различия е генетично детерминирана, се говори за изоензими. Когато различията в молекулата на ензима се дължат на променена синтеза на белтъка, се използва терминът мултиплени форми. Същевременно мултиплени форми е по-общо понятие, което включва и изоензимите. Изоензими и мултиплени форми могат да показват различия по отношение на електричния заряд, каталитичната активност, чувствителността към денатуриращи влияния и потискане на активността, антигенните свойства. В клиничната диагностика тези ензимни форми имат относително малко значение независимо от това, дали са изоензими (например аспартатаминотрансферази, лактатдехидрогенази, креатинкинази), мултиплени форми (например ариламидази) или комбинация от тях (например алкални фосфатази). Изоензимите имат значение при решаване на въпроси, свързани с генетични проблеми. Намалената или липсващата каталитична активност на някои изоензими например може да бъде причина за обменен блок (фенилкетонурия, галактоземия).

Методична основа за ензимната диагностика е измерването на скоростта на катализираните реакции. Ензимната активност е мярка за скоростта, с която протича катализираната от дадения ензим химическа реакция при стандартизирани условия in vitro. Резултатите от измерването се представят в единицата от SI  μmol.s⁻¹.1⁻¹. Лесно може да се извърши преизчисление на единиците пo SI във все още ползваните международни единици (UI). Понякога в литературата се ползва единицата пo SI "катал" (kat), като 1 kat = 1 mol.s⁻¹ (производни микрокатал, нанокатал). Измерваната in vitro ензимна активност освен от наличното количество ензим зависи и от запазването на пространствената структура на изследвания ензим и от условията, в които се провежда реакцията. Чувствителността на ензимните белтъци спрямо денатуриращи влияния поставя много строги условия за спазване на указанията за получаване, съхраняване и подготовка на биологичния материал за изследване. Зависимостта от условията на реакцията затруднява значително международната стандартизация. Въз основа на значителните различия в стайната температура невинаги е възможно пряко съпоставяне на резултатите от измерените ензимни активности. Все още липсва утвърдена оптимална температура за извършване на ензимни изследвания. Възможностите за преизчисление на получените резултати също трябва да се възприемат критично, тъй като в повечето от случаите се изследват смеси от изоензими и мултиплени форми, чието повлияване от температурата и други каталитични условия може да се различава значително. В такива случаи е оправдано съпоставянето на степента на промяна на ензимната активност спрямо референтните граници. При диагностична интерпретация могат пряко да се съпоставят само специфични за даден метод референтни стойности.

За диференциране на изоензими и мултиплени форми се ползват различни методични подходи:

• хроматографско, съответно електрофоретично разделяне (например креатинкинази, лактатдехидрогенази)
• имунологично разделяне (например креатинкинази, алкални фосфатази, кисели фосфатази)
• разделяне въз основа на чувствителността към денатуриращи въздействия (например алкални фосфатази)
• потискане (например кисели фосфатази, холинестерази)

Имунологичното диференциране позволява най-надеждното количествено определяне на активността на изоензимите и се очаква в бъдеще да бъде използвано все по-широко.