Полимеразна верижна реакция (ПВР)

Описание на метода

В редицата на съвременните генетични технологии методът полимеразна верижна реакция заема особено място.

Този метод повдига генодиагностиката на принципно друго равнище – на ниво, при което се определя самата ДНК или РНК и което позволява да се осъществи директно откриване на инфекциозен агент или на генетична мутация. С негова помощ една молекула ДНК може да се открие в присъствие на милиони други молекули ДНК. Възможностите му могат образно да се представят със сравнението „да се търси игла в купа сено“. Разнообразни са приложенията, които намира в различни области – в научните изследвания, в медицината, във ветеринарията, в криминалистиката – идентификация на личността, доказване на бащинство.

Най-ефектно е ползването на ПВР в медицината. Методите на ДНК-диагностиката са незаменими в пренаталната диагностика на наследствените заболявания, като миодистрофията на Дюшен и Бекер, муковисцидозата, фенилкетонурията, хемофилията, атаксията на Фридрейх и спиналните амиотрофии, установяване на пола на детето. Пренаталната диагностика, проведена в първото тримесечие на бременността, позволява да се предотврати раждането на дете с тежка наследствена патология, а в случая на недостатъчност на 21-хидроксилазата – да се проведе и дородово лечение. В имунологията може да се установи какви гени контролират синтеза на едни или други съединения и медиатори на имунния отговор, да се проведе типиране на тъкани.

Откриването на тази реакция проведе истинска революция в биологичната наука: изследователите получиха мощен инструмент за разбиране на механизмите на диференциация на клетките, за изясняване на това какви гени работят на различни етапи от развитието на организма в норма и при патология, за изясняване на въпроси от еволюцията.

Полимеразната верижна реакция е процес на амплификация (умножаване, копиране) ин витро на ДНК-молекула, с чиято помощ в течение на няколко часа една молекула ДНК може да се размножи в количество, превишаващо изходното в милиони пъти. В сегашно време ПВР представлява процес, протичащ в една епруветка и състоящ се от повторни цикли на амплификация на специфична ДНК-молекула с цел получаване на достатъчно голямо количество копия, които да могат да се детектират с помощта на обичайни лабораторни методи. Ключов компонент на реакцията се явяват праймерите (зародишите) – синтетични олигонуклеотиди, състоящи се от 20 – 30 нуклеотида, които са комплементарни на определени сайтове (участъци) от ДНК-молекулата и се присъединяват към тях. Процесът на техния подбор е емпиричен, вече са създадени специални компютърни програми, основани на термодинамични подходи. Праймерите за ПВР обикновено имат дължина от 20 нуклеотида. Може да се синтезират и по-дълги, но те рядко се ползват. Праймерите се подбират за консервативни участъци от ДНК-молекулата на инфекциозния агент, които са малко подложени на генетични изменения. Необходимите за провеждане на реакцията дезоксинуклеотидтрифосфати (дНТФ): дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ имат еднакви концентрации в сместа, защото количеството в повече на някой от тях може да доведе до неправилно сдвояване на нуклеотидите при провеждане на реакцията. Концентрацията на магнезиеви йони има особено важно значение не само за работата на ензима (определя се чрез титриране), а и за другите компоненти на реакцията (нуклеиновите киселини, дНТФ, праймерите).

Всеки цикъл на ПВР се състои от три стадия, протичащи при различна температура – денатурация, присъединяване и удължаване.